Western blot是个很考验耐心和动手能力的实验。
曾经有位师弟说：“做完WB后，感觉整个人都成熟了”。
其实，做WB之前最好能够先熟悉原理，然后才可能在实操过程中发现问题和校正流程。不同实验室的条件不同，因此WB跑胶、转膜条件并不是普适的，必须根据具体情况进行调整，切忌刻舟求剑。
曾经有几位朋友咨询，说为啥自己的条带是弯的。看完，我立马想到这个动图了，哈哈......
条带发弯不是小问题，会让造成maker指示不准、误切目标条带、分析困难以及上图不美观等。因此，有必要就这个问题做出分析。
1. 凝胶问题
尽管现在已经有商用预制胶了，但大多数实验室还是没丢掉传统手艺，自己配胶。WB凝胶上部为浓缩胶，下部为分离胶。一般是等待分离胶充分凝固后，再缓慢倒入浓缩胶，最后插上梳子。
制胶架不在水平位置上或分离胶未充分凝固就急于灌入浓缩胶，是导致条带整体变弯或倾斜的重要原因。
（图片均来自网络）
如果你默认自己配的胶没问题，在后续切割凝胶时还是按照水平角度切，那么极可能将自己的目标调点给切掉。实验直接失败。
2. 凝胶中有泡泡
在配制凝胶时，将小烧杯放在实验操作台上轻轻摇晃达到溶解目的。绝对不要搅拌溶液，否则凝胶灌入玻璃板后会形成很多小泡泡。大的泡泡可以用滤纸吸破，但肉眼难以发现一些小泡泡。
这些小泡会形成一个窝坑。跑胶时，蛋白难以绕过这个坑，会形成弯弯扭扭的形状。当然，这种情况也可能是玻璃板没洗干净，以前的老渣滓拦住蛋白了。
3. 上样孔问题
合格的上样孔应该是底部水平的。但如果梳子不干净就用或者冲洗上样孔，则会造成条带畸形。
假如你上完样品后，发现蛋白样品在上样孔底部并不均匀整齐，那说明这个上样孔不太干净，此时已难以补救了。
所以，最好的办法是一开始就避免发生。配完胶，插梳子之前检查一下梳子有没有洗干净，确认无既往残渣后再插。上样前，轻轻拔下梳子，用加样枪吸取缓冲液轻轻冲洗上样孔，将上样孔内残留的凝胶碎屑冲掉。
4. 跑胶电压问题
电压过高是导致条带呈现“笑脸”的最主要原因。
通电后，凝胶中会形成一个大致“U”型的电场。电压越小，U型越平；电压越大，U型越陡。
所以有些人在做WB时，追求快，想要减少跑胶时间，往往会将电压调到很大，那么蛋白会在强电场作用下形成笑脸状。一个典型的表现就是，如果电压很大，跑胶时会看到左右两侧的maker向中部倾斜。
尤其是在做大分子量蛋白时，凝胶浓度较低，蛋白条带更容易受到强电场作用影响而变倾斜。
因此，菌菌推荐大家在跑胶时要耐心，不要追求大电压，而是根据实验室经验调至合适大小。否则后期分析条带时就会出现如下尴尬场景，这样的图用到论文中也是不太美观的。
Ending
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2021-02-01
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2021-01-20
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文章转载自微信公众号生物实验菌
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